概述

β-葡萄糖醛酸酶对于不同的检测其水解效率也不尽相同。此研究实验通过对大蜗牛（Helix pomatia）β-葡萄糖醛酸酶（Sigma），红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶（Kura Biotec®）和IMCSzyme®的重组β-葡萄糖醛酸酶（IMCS）在酶浓度，孵育时间和孵育温度的比较及优化，说明水解条件对酶的使用及药物检测的影响及重要性。

材料与方法

1.      在测试15个患者样本之前，先对每一种酶的水解条件进行优化，包括：酶的使用浓度（5000-25000 U/mL），孵育时间（30，60，90分钟），孵育温度（50℃，55℃，68℃）。

2.      条件优化后，在三天内分批测试患者样品一式三份。

3.      每批次样本检测做一次五点标准曲线和2个质控QC样本。

4.      样本分析使用Waters TQ-S质谱和阳离子电喷雾模式。

5.      流动相A为5 mM 甲酸铵（pH3.0），流动相B为含有0.1%甲酸的乙腈。

6.      柱子为Waters XSelect HSS C18 2.5 μm, 2.1x150 mm XP和Phenomenex C18 SecurityGuard ULTRA Cartridge。

结果

1.      水解条件优化实验显示， 大蜗牛（Helix pomatia）和红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶的孵育时间、IMCSzyme®的孵育温度均影响回收率。 大蜗牛（Helix pomatia）和红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶最佳水解时间为90分钟，IMCSzyme®仅为30分钟。大蜗牛（Helix pomatia）β-葡萄糖醛酸酶最佳使用浓度为5000 U/mL，最佳孵育温度为50℃；红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶最佳使用浓度为25000 U/mL，最佳孵育温度为68℃；IMCSzyme®最佳使用浓度为14667 U/mL，最佳孵育温度为55℃。

2.      在每种酶的最佳水解条件下，比较了可待因-6β-D-葡萄糖苷酸的回收率。使用大蜗牛（Helix pomatia）β-葡萄糖醛酸酶其回收率仅为50%，红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®则可达到100%。

3.      15个病人样本的检测中，可待因、去甲可待因、吗啡、氢吗啡酮、氧吗啡酮的水解效率差异显著。使用红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®时回收率有所提高。

4.      每批次样本的所有分析物的变异系数百分比（CV%）≤ 11%，R² ≥ 0.995。

5.      质控QC样本值均在已知值的20%内（除了吗啡检测）。

6.      大蜗牛（Helix pomatia）β-葡萄糖醛酸酶水解时吗啡的偏差为40%，使用红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®则小于2%。

7.      使用红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®时，检测氢吗啡酮、氧吗啡酮的偏差小于10%。

8.      红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®的相关性见图1。

9.      对于海洛因的暴露问题，实验中比较了两名患者三种酶的吗啡/可待因的比值（表1）。如表1所示，对样本1和2，大蜗牛（Helix pomatia）β-葡萄糖醛酸酶时，吗啡/可待因的比值比红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®高4和7倍。因为6-乙酰吗啡的半衰期很短，吗啡/可待因的比值对区分海洛因暴露和可待因暴露中有重要作用。

结论

水解条件的优化对于酶使用及药物检测十分重要。当条件不是最佳时，可能导致水解不完全进而出现假阴性结果。如果检测中没有全部检测到分析物，研究人员则应对所使用的酶进行各种条件的优化。在此建议下，实验人员将会获得更加可信的结果。

图1. 红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®的相关性。

可待因斜率为9.5，其它分析物的斜率为0.9-1.4。吗啡偏差为40%，红鲍（Haliotis rufescens）β-葡萄糖醛酸酶和IMCSzyme®的偏差＜ 2%。

表1. 吗啡与可待因的比值

此项研究为IMCS总结于技术研究报告“Hydrolyze Your Way to Compliance- A Call for Pain Management Certified reference Material”（于2016年美国MSACL会议上由Heather Hochrein发表）。

This information was summarized by IMCS from the technical poster “Hydrolyze Your Way to Compliance- A Call for Pain Management Certified reference Material” presented by Heather Hochrein - UC San Diego Health at MSACL 2016.

IMCSzyme® is a registered trademark of IMCS, LLC
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